Le citochine infiammatorie svolgono un ruolo dominante nella patogenesi della degenerazione del disco. I campi elettromagnetici pulsati (PEMF) sono stimoli biofisici non invasivi che sono stati ampiamente utilizzati nel campo ortopedico per molti anni. Tuttavia, le risposte cellulari specifiche ei meccanismi coinvolti non sono ancora chiari. L'obiettivo di questo studio era di valutare gli effetti PEMF dipendenti dal tempo sull'espressione del fattore pro-infiammatorio IL-6 nelle cellule del nucleo polposo del disco utilizzando un nuovo sistema reporter della proteina a fluorescenza verde (GFP).
È stato costruito un sistema reporter GFP con tag MS2 guidato dal promotore IL-6 per visualizzare l'effetto del trattamento PEMF sulla trascrizione di IL-6 in singole cellule viventi. Le cellule marcate con IL-6-MS2 sono state trattate con IL-1α per imitare l'ambiente infiammatorio in situ del disco degenerativo mentre contemporaneamente sono state esposte a PEMF continuamente per 4 ore.
L'imaging time-lapse è stato registrato utilizzando un microscopio confocale per monitorare l'attività di trascrizione dinamica di IL-6 che è stata dimostrata da GFP. Infine, è stata eseguita la RT-PCR in tempo reale per confermare i dati di imaging. L'imaging cellulare vivo ha dimostrato che il fattore pro-infiammatorio IL-1α ha promosso significativamente la trascrizione di IL-6 nel tempo rispetto alla condizione del mezzo basale DMEM. I dati di imaging e PCR hanno dimostrato che l'effetto induttivo di IL-1α sull'espressione di IL-6 potrebbe essere significativamente inibito dal trattamento con PEMF in modo dipendente dal tempo (presto 2 ore dall'inizio dello stimolo).
I nostri dati suggeriscono che la PEMF può avere un ruolo nella gestione clinica dei pazienti con lombalgia cronica. Inoltre, questo studio mostra che il sistema di reporter GFP con tag MS2 è uno strumento utile per visualizzare gli eventi dinamici della meccanobiologia nella ricerca muscoloscheletrica.
© 2017 Gli autori. Journal of Orthopaedic Research® Pubblicato da Wiley Periodicals, Inc. per conto della Orthopaedic Research Society. J Orthop Ris 35:778-787, 2018.
Figura 1 Schema dei costrutti MS2 utilizzati in questo studio. Plasmide A) Plasmide della proteina di fusione PGK-MS2-GFP, esprime la proteina di fusione MS2-GFP; L'mRNA reporter del plasmide B, esprime una sequenza ripetuta MS2 × 24 guidata dal promotore IL-6 (IL-6-RFP-MS2). Le singole cellule trasfettate (plasmide A, lato sinistro) hanno mostrato una fluorescenza verde diffusa concentrata all'interno del nucleo cellulare a causa della sequenza di localizzazione nucleare (NLS); Nelle cellule co-trasfettate (lato destro), la proteina di fusione co-esprime con l'mRNA reporter contenente siti di legame MS2. La proteina di fusione si lega in modo specifico a una delle 24 copie del motivo RNA contenuto nella sequenza ripetuta MS2 × 24. Il legame risultante di più copie della proteina di fusione MS2-GFP all'mRNA forma particelle di colore verde brillante nelle cellule (particolarmente indotte dal fattore pro-infiammatorio IL-1α).
